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导语/当血小板激活后，血小板之间产生聚集，需要一个重要的受体的介导。这个受体，有复杂的结构和激活途径，这个受体也是重要的抗血小板聚集的治疗靶点。通过本文，学习了解。在前面的文章中，我们介绍了抗血小板药物分类中的阿司匹林和P2Y12受体拮抗剂。这次我们来介绍另外一类抗血小板药物，即GPIIb/IIIa受体拮抗剂，代表药物为依替巴肽（Eptifibatide），替罗非班(Tirofiban)和阿昔单抗（Abciximab）。被激活之前，GPIIb和GPIIIa都是独立的糖蛋白，分布在细胞膜表面，SCCS表面（表面连接的开放小管系统）和α颗粒表面（30%）。被激活后，GPIIb和GPIIIa形成异二聚体（Heterodimer），也就是我们常说的GPIIb/IIIa受体。GPIIb/IIIa受体是纤维蛋白原和vWF的受体，介导血小板之间的聚集。糖蛋白GPIIb/IIIa，是一种电泳命名法。它还有其他的名字。根据当前命名法，也叫整合素αIIbβ3；根据分化簇命名法，构成GPIIb/IIIa受体的两个亚单位分别称为CD41（ 对应GPIIb）和CD61（对应GP IIIa）。图片
本文中将统一采用当前命名法，即整合素αIIbβ3 (Integrin: αIIbβ3），在本文对这个受体蛋白进行介绍。介绍这个受体的结构，配体的结合，信号传导通路，临床中使用的拮抗剂的类型等内容。一、整合素的介绍（Integrin introduction）整合素(Integrins)是一类重要的跨膜糖蛋白（GP）受体，由α亚单位和β亚单位（Subunit）组成。（注：亚单位，也叫亚基）上述α和β两个亚单位，都有胞外结构域（Extracellular domain）、跨膜结构域(Transmembrane domain)和细胞质结构域(Cytoplasmic domain)，由3部分组成。除了介导细胞和细胞外基质（ECM）之间的通信外，整合素(Integrin)还可以实现细胞间的相互作用。因此，整合素在细胞粘附、存活和分化中起着重要作用。整合素（Ingegrins) 家族成员可以由18个α亚单位和8个β亚单位组装而成，这些亚单位可以形成24个对细胞功能有不同影响的整合素。1.1 α亚单位α-亚单位可分为两类：即具有插入域（αI）（With inserted domain）和不具有插入域(Without inserted domain)的亚单位。这个插入结构域，具有金属离子依赖性粘附位点（MIDAS, Metal ion-dependent adhesion site），它允许配体结合至受体。包含插入域（Inserteddomain）的9个α亚单位是胶原纤维受体(α1,α2, α10, α11) )和白细胞受体(αE, αL, αM, αD, αX)的一部分。没有插入域的另外9个α亚单位可以根据进化(Evolution)和特异性(Specificity)分为四类：A类：Arg-Gly-Asp(RGD)序列受体（αIIb,αv, α5, α8）B类：层粘连蛋白受体（α3，α6，α7）C类：PS3（只发现于昆虫）D类：α4和α9亚单位。注：RGD序列，是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的3肽结构。1.2 β亚单位在整合素中发现的8个不同的β-亚单位（β1-β8），其中两个，即β1和β3，发现于血小板上。含有β1的整合素，称为β1整合素，包括α2β1，α5β1和α6β1，支持血小板粘附于胶原（Collagen），纤维蛋白原（Fibrinogen）和层粘连蛋白（Laminin）。1个血小板上具有1000个β1整合素。αvβ3和αIIbβ3整合素都属于β3整合素（两者分子结构非常类似）整合素αIIbβ3是血小板上数量最丰富的整合素，每个血小板上大约有8万个拷贝，对于止血至关重要。整合素αvβ3发现于平滑肌细胞和内皮细胞上，而在血小板上数量较少（每个血小板上 大约50-100 个拷贝）。整合素通常在非活性（Inactive state）状态下表达，添加Mn2+可以增加配体的结合亲和力(Affinity)。血液中存在Ca2+，对于整合素在保持非活性状态，起到至关重要的作用。二、整合素αIIbβ3（Integrin αIIbβ3）αIIbβ3的α亚单位由1008个氨基酸（Amino acids）组成，其结构为：一个细胞质尾部 (Cytoplasmic tail)一个跨膜结构域 (Transmembranedomain)两个小腿(Calf)结构域、一个大腿(Thigh)结构域一个头部（β-Propellerdomain，β-螺旋桨结构域），是主要的配体结合结构域αIIbβ3的β3亚单位，由772个氨基酸(Aminoacids) 组成，其结构为：一个细胞质尾部(Cytoplasmictail)一个跨膜结构域(Transmembrane domain)一个膜近端β尾结构域（βTD结构域， membrane-proximal-β-tail domain）四个表皮生长因子结构域（EGF, epidermal growth factor domain）一个混合结构域（hybriddomain）一个β3A结构域（头部）。图片
Figure 1. 在αIIbβ3整合素的非活性构象（A图）中，配体结合位点对其配体的可及性较差，而在活性构象(B 图）中，配体结合位点表现出对其配体的高亲和力。β3亚单位包含一个由二硫键（Disulphide bonds）稳定的多肽链，激活后，通过二硫化物交换反应，生成游离硫醇（free thiols），会重新排列。整合素具有多个二价阳离子（Divalentcation）结合位点，这是配体结合所必需的。这两个亚单位的细胞质结构域形成配体结合域（Ligand binding domain）,用于结合细胞内细胞骨架分子（Intracellular cytoskeletal molecules）。α-亚单位（αIIb）与β-亚单位（β3）的相互作用，由α亚单位的β-螺旋桨结构域和β亚单位的β3A结构域控制。（小编注：两个亚单位的头部，相互作用）小编注：也就是说，αIIbβ3受体，在细胞外的部分，由头端的结构，来结合细胞外的配体，如纤维蛋白原等；而在细胞内的部分，也可以结合细胞内的一些分子，因此，从外部，或者从内部，都可以激活受体。提供一张 αIIbβ3的冷冻重建电镜图像（Cryo-EM）和旋转阴影电镜图像（rotary-shadowed EM），帮助大家更多了解αIIbβ3的结构。（Figure 2）图片
Figure 2（A） 冷冻EM重建 ，分辨率为20Å。(B)和(C)是旋转阴影EM图像。B中的图像在1mM Ca2+存在下获得；C中的图像，在1 mM Mn2+下获得。注：Å(埃)，长度计量单位,1埃=0.1纳米）感兴趣的朋友，也可以看看下方这张图(Figure 3)，这是αvβ3整合素的细胞外部分的带状结构（Ribbon structure）。A图是弯曲状态（无活性），B图是延伸状态（有活性）。其结构，与αIIbβ3的结构，非常相似。（共同的β3亚基，只是α亚基不同）图片
Figure 3 αvβ3整合素的细胞外部分的带状结构完整内皮细胞（Intact endothelium）产生的一氧化氮（NO）和前列环素（PGI2），抑制盘状静息状态血小板的激活。在止血过程中，整合素αIIbβ3在血小板的粘附和聚集中起到非常关键的作用。血管壁受损，血小板被激活。血小板通过GPIb-V-IX受体与结合胶原的vWF相互作用。除了促进血小板与受损血管壁的粘附外，vWF还可增强高剪切条件下（High shear conditions）的血小板聚集。血小板激活后，α颗粒和致密颗粒（Dense granules）的内容物被分泌，通过释放ADP，进一步增强血小板的活化。血小板一旦被激活，整合素αIIbβ3就发生构象改变（Conformation change），暴露配体结合位点，即纤维蛋白原受体，在静息的血小板上是无法获得的，随之，纤维蛋白原交联很多的血小板聚集，形成血小板栓子。格兰兹曼血栓症（Glanzmann thrombasthenia）患者，是一种罕见的常染色体隐性(Autosomal recessive)遗传病，由编码GPIIb和IIIa的基因突变引起的疾病，患有出血发作倾向。另一方面，整合素αIIbβ3功能紊乱可能导致血栓性并发症，如缺血性中风和心肌梗死。巨核细胞中β3的部分缺失将导致异常的大血小板、巨血小板减少（PLT ＜150x109/L）和出血倾向。三、配体（Ligand)整合素αIIbβ3具有多个配体（Ligands），可以分类为：1，包含RGD基序的配体（纤维蛋白原、纤维蛋白、vWF、纤维连接蛋白）。2，其他配体结合基序(Ligand-binding motifs)，如，来自纤维蛋白原γ链C末端的KQAGDV序列，是纤维蛋白原的主要结合位点。四、内-向外信号传导（ Inside-out Signalling）血小板激活和随后的细胞内信号传导时，所谓的“由内而外”（Inside-out ）信号，整合素αIIbβ3会发生构象改变（Figure 4）。图片
Figure 4：血小板由内向外的信号传导（Inside-out signalling）的示意图。激活剂（Agonist）激活G蛋白偶联受体（GPCR），启动信号传导通路上关键的信号蛋白（Signalling proteins），比如磷脂酶C（PLC）、蛋白激酶C（PKC）和磷脂酰肌苷-3-激酶（PI3K）。细胞质内Ca2+增加会导致CalDAG-GEFI激活，从而进一步激活Ras-相关蛋白1（RAP1）。RASA3作为RAP1激活的负性调节器（Negative regulator），RASA3的活性受到PI3K激活的限制。通过talin头部(Talin head)和尾部结构域（Tail domain）的分离，talin头部结构域与细胞质β3亚单位（β3 subunit）的尾部关联，将整合素αIIbβ3从非活性形式（Inactive form）转换为活性形式(Active form)。注：CalDAG-GEFI ：钙和DAG调节的鸟嘌呤交换因子-1；RASA3: Ras-GTP酶激活蛋白3 (Ras GTPase-activating protein 3)，是一种靶向Ras和Rap1的GAP1家族GTPase激活蛋白。RAP1：Ras相关蛋白1。整合素处于非活性状态(Inactive state)时，细胞外结构域（Extracellular domain）折叠，配体结合位点面向血小板膜。当细胞外结构域扩展（打开）时，转变为活性状态（Active state），暴露RGD配体结合域，使其具备配体的高亲和力（Figure 1）。在这种高亲和力状态下，αIIb和 β3亚基的细胞质尾部(Cytoplasmic tails) 松开(Unclasp)，分离跨膜结构域(TM domains)。可溶性激动剂（如，ADP、凝血酶、血栓素A2）或粘附配体（如，胶原蛋白、vWF、纤维蛋白原）与各自的受体结合引发血小板激活，触发信号通路（Signalling pathways），涉及磷脂酶（PLC）、蛋白激酶C（PKC）和磷脂酰肌苷-3-激酶（PI3K）等关键信号蛋白（Key sigalling proteins）。这些信号事件（signalling events）最终导致小的GTP酶RAP1（Ras相关蛋白1）的激活，RAP1是整合素αIIbβ3激活的重要调节因子。RAP1由其激活剂CalDEG-GEFI调节，CalDAG-GEFI对细胞质Ca2+升高作出反应，RASA3作为RAP1激活的负调节因子。对于整合素的持续激活，RASA3的活性需要受到限制，这需要通过PI3K激活来实现。RAP对血小板的影响仍有待确定。除了RAP1激活外，由内而外（Inside-out）的信号传导，导致招募肌动蛋白细胞骨架蛋白（Actin cytoskeletal proteins）talin和kindlin并结合至αIIbβ的细胞质尾部（Cytoplasmic tail）。通过Talin头部和尾部结构域的分离，Talin头部结构域可以与β3-亚单位细胞质尾部关联，该尾部将整合素αIIbβ3从将非活动状态转换为活动状态（Figure 5）。图片
Figure 5 调节αIIbβ3活性状态的“推-拉”假说。白色和蓝色柱状体，分别代表αIIb亚单位的TM（跨膜区域）和近膜胞质结构域螺旋；红色和绿色，分别代表β3亚单位的TM（跨膜区域）和近膜胞质结构域螺旋。kindlins在这些整合素调节中的重要性已经非常明确。Kindlin-1存在于上皮细胞中，Kindlin-2存在于实体间充质组织（Solid mesenchymal tissue），kindlin-3存在于造血细胞中（Hematopoietic cells）。细胞研究显示，kindlins只能与talin一起激活整合素。五、外-向内信号传导（Outside-in signalling）配体与整合素αIIbβ3结合，将触发细胞内多种复杂信号传导事件，称为“外向内信号传导”（Outside-in signalling），促进肌动蛋白聚合（Actin polymerization）和细胞骨架重组(Cytoskeletal reorganization)。多价配体（Multivalent ligands）聚集整合素，进一步促进“外向内信号”。“外向内信号”驱动重要的止血过程，如血小板扩散（Platelet spreading）、稳定的血栓形成和血栓收缩(Clotretraction)（Figure 6）。其中一个最早发生的事件是Src激酶家族（SFK），c-Scr, Lyn和Fyn对不同蛋白质的酪氨酸磷酸化(Tyrosine phosphorylation)。血小板活化后，c-Src与β3整合素尾部关联，并被激活。图片
Figure 6. 血小板“外向内信号”示意图概述聚集的整合素（Clustered integ）将启动由“外向内信号传导”。c-Scr与β3结合至整合素尾部并被激活。Scr、Syk和FAK将通过酪氨酸磷酸化（Tyrosine phosphorylation）调节下游信号。“外向内信号”导致血小板扩散、聚集、细胞骨架重组和血栓形成。Gong等人的研究表明，G蛋白亚单位Gα13与β3整合素尾部的结合，促进c-Src活化。SFK激活之后导致酪氨酸激酶Syk的磷酸化和激活，并与β3细胞质尾部相互作用。此外，SFK诱导β3尾部磷酸化（Phosphorylation）会促进募集（Recruitment）细胞内适配器蛋白(Intracellular adaptor proteins) 。在SFK和Syk的下游，许多信号和细胞骨架蛋白（Cytoskeletal proteins）发生磷酸化和/或活化，如PKC（蛋白激酶C）、PLCγ2(磷脂酶Cγ2），FAK（粘着斑激酶），PI3Kβ和RhoA（Ras同源家族成员A）。PI3Kβ被证明对血栓稳定性非常重要，RhoA调节血小板扩散和血栓收缩。Talin和kindlin-3通过将β3尾部直接连接到肌动蛋白细胞骨架（Actincytoskeleton），似乎在”外向内信号”传递中起重要作用。此处，小编想说，细胞内信号传导，实在是太复杂了，目前，仍然有很多东西没研究透。但是有一点是比较明确的，即，细胞外的活性物质，如ADP或TXA2，能够通过相应的受体，通过相应的细胞内信号传导通路，来激活αIIbβ3受体变成活性状态，引起血小板聚集。这些信号通路，一定不是各自独立的，一定给会有共同的几个分子，几个酶，即所谓的“共同通路”。因此，服用阿司匹林或者P2Y12受体拮抗剂，最终对αIIbβ3受体和血小板聚集能力的影响，一定会有交叉。六、 临床中应用的αIIbβ3受体拮抗剂目前在临床中，有三种αIIbβ3拮抗药物，分别为依替巴肽（Eptifibatide），替罗非班(Tirofiban)和阿昔单抗（Abciximab）。其中，依替巴肽（Eptifibatide）和替罗非班(Tirofiban)，是从蛇毒中提取的去整合素（Disintegrin），是低分子量的化合物。阿昔单抗（Abciximab），是一种与αIIbβ3结合的人/鼠嵌合单克隆抗体（Chimeric monoclonal antibody）。根据这些药物与αIIbβ3受体结合位点的不同，可以分为2大类，如下：6.1 β3链结合（β3chain binding)Abciximab(阿昔单抗）阿昔单抗（47.6 kDa）是小鼠/人嵌合抗体（Chimericantibody）的Fab片段。当阿昔单抗结合整合素受体的β3链时，纤维蛋白原等配体进入结合口袋（Binding pocket）的能力受损。（Figure 7）图片
Figure 7：拮抗剂在αIIbβ3整合素上不同的结合位点。位点1，KQAGDV，位于α亚单位上：是纤维蛋白原（Fibrinogen）主要的结合位点，也是阿昔单抗二级结合位点。位点2，亚单位之间的结合袋（Binding pocket）：依替巴肽和替罗非班的结合位点，因此与纤维蛋白原竞争。位点3，配体结合袋，位于β亚单位上：阿昔单抗和Echistatin(蛇毒锯鳞蝰素）的主要结合位点，因此不与纤维蛋白原竞争。阿昔单抗对αIIbβ3整合素并不具有特异性（Not specific），它还能以相同的亲和力（Kd5 nM）封闭玻连蛋白受体(Vitronectinreceptor)，即αvβ3受体。并能阻断白细胞上的MAC-1受体，尽管亲和力较低（ Kd 160 nM ）。给药后，血小板功能将在24至36小时内恢复，但在给药后2周，阿昔单抗仍然结合至血小板上。虽然阿昔单抗结合αIIbβ3的主要位点，是β3亚单位的“配体结合袋”（结合囊）（Ligand-binding pocket），它还可以结合到KQAGDV（次要位点），这是αIIb亚单位的一部分。阿昔单抗通过空间位阻（Steric hindrance）或构象效应(Conformationaleffects)，阻止配体连接到β3的“结合袋”（结合囊）。阿昔单抗可以结合非激活和被激活的血小板。阿昔单抗用于接受直接经皮冠状动脉介入治疗（Primary percutaneous coronaryintervention）和心肌梗死缺血的患者，与肝素和乙酰水杨酸（Acetylsalicylic acid）一起。阿昔单抗的副作用包括血小板减少（Thrombocytopenia）、出血、腹痛、恶心(Nausea)和呕吐(Vomiting)。阿昔单抗的结构示意图见Figure 8 。图片
365建站客服QQ：800083652365建站Figure 8：替罗非班和依替巴肽的化学结构，包括分子量。阿昔单抗显示为示意图。小鼠可变链区域显示为灰色（轻链）和黑色（重链）。人类恒定区域显示为浅蓝色（轻链）和深蓝色（重链）。6.2 αIIb和β3亚基之间的结合袋6.2.1Eptifibatide(依替巴肽）依替巴肽（Integrilin, 832Da）是一种环状七肽（Cyclic heptapeptide），含有同源精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（hArg-Gly-Asp）序列，来源于去整合素“巴布林”（Barbourin，一种蛇毒多肽，P22827），发现于东南部侏儒响尾蛇（Sistrurus miliarius）的毒液中。（化学结构见Figure 7）依替巴肽的血浆半衰期为3小时。通常进行环化反应（Cyclisation）用于限制肽的确认（Confirmation of a peptide），并降低被蛋白酶降解的易感性。（小编注：通过环化，逃离监管识别，不容易被降级）依替巴肽（Eptifibatide）对αIIbβ3不具备特异性，它也能结合至αvβ3，但是亲和力较低（Lower affinity）。依替巴肽的结构，基于巴布林（Barbourin）的KGD基序，为了增强亲和力，赖氨酸(Lysine)被同型精氨酸残基（Homoarginine residue）所取代。依替巴肽可与非激活和被激活的血小板结合。依替巴肽的结合位点是αIIb和β3亚单位之间的“结合袋”（Binding pocket），从而阻断纤维蛋白原（Fibrinogen）的结合域，抑制血小板血栓的形成（Figure 7）。因为依替巴肽的结合位点位于αIIbβ3的配体结合袋中，依替巴肽会与纤维蛋白原和vWF竞争结合位点，而不是阿昔单抗的结合位点。依替巴肽用于心绞痛患者以预防心肌梗死和接受直接经皮冠状动脉介入治疗的患者，通常与普通肝素和乙酰水杨酸联合使用。依替巴肽的副作用是出血、血小板减少和低血压。6.2.2替罗非班（Tirifiban）替罗非班（AGRASTAT，440Da）是一种人工合成的，非肽类（Non-peptide），可逆的（Reversible）血小板整合素αIIbβ3拮抗剂。（化学结构见Figure 7）替罗非班被设计用来模拟去整合素Echistatin中的RGD识别基序（RGDrecognition motif）（Echistatin从锯鳞蝰蛇Echis carinatrus的毒液中分离得到)。替罗非班可以通过肾脏排泄从血浆中清除，半衰期为2小时。与依替巴肽相比，替罗非班对αIIbβ3受体具有更高的亲和力（Kd 15 nM）。替罗非班识别RGD-结合基序（Binding sequence）并与αIIbβ3受体中的“配体结袋”，与纤维蛋白原和vWF竞争。（注：作用位点和竞争关系，与依替巴肽相同）。替罗非班能够结合至非激活和激活的血小板。替罗非班用于急性冠脉综合征（ACS）的患者和接受直接经皮冠脉介入治疗的患者（Primary percutaneous coronaryintervention ），通常与肝素联合使用。替罗非班的副作用包括头痛、恶心、血小板减少症和出血。七、结论为了预防急性冠脉综合征（ACS）或者不稳定型心绞痛患者的血栓并发症，临床中偶尔会用到αIIbβ3拮抗剂，即依替巴肽（Eptifibatide），替罗非班(Tirofiban)和阿昔单抗（Abciximab），都是静脉使用。依替巴肽（Eptifibatide）和替罗非班（Tirofiban）基于配体（RGD）模拟物，以低亲和力与整合素结合，并诱导构象变化，从而导致“由外向内”的信号传导和反常的血小板活化（Paradoxical platelet activation）。血小板减少症(Thrombocytopenia)是由抗体引起的免疫反应的结果，整合素/抑制剂相互作用后，暴露配体诱导的结合位点LIBS（Ligand-inducedbinding sites），抗体针对这个位点，介导免疫反应。通常，使用阿昔单抗后血小板减少更频繁，是由于暴露了更多的表位（Epitopes），这些表位可以被已经存在于血液中的抗体识别。自从目前的αIIbβ3拮抗剂获得批准以来，没有再开发出新的αIIbβ3抑制剂。已经证实，αIIbβ3抑制剂在预防缺血/再灌注损伤，保护心脏功能方面，存在很好的效果。未来的方向，可以基于外源性去整合素（Exogenous disintegrins）的结构-功能分析，这可能有助于寻找能够维持止血，且副作用较少的血小板拮抗剂。（完）思考的问题嗜血寄生虫，毒蛇，也具有天然抗血小板成分？有没有口服的αIIbβ3受体拮抗剂？后文详述，欢迎关注【参考文献】van den Kerkhof D L, van der Meijden P E J, Hackeng T M, et al. Exogenous Integrin αIIbβ3 Inhibitors Revisited: Past, Present and Future Applications[J]. International journal of molecular sciences, 2021, 22(7): 3366.Bennett J S. Structure and function of the platelet integrin α IIb β 3[J]. The Journal of clinical investigation, 2005, 115(12): 3363-3369.如果您认为本文不错，希望帮忙转发，让更多的人知道，帮助更多的人学习。感谢您的支持。医学薅羊毛感兴趣的，加个关注。一起学习，共同进步。 本站仅提供存储服务，所有内容均由用户发布，如发现有害或侵权内容，请点击举报。